凝膠色譜法簡介

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凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果。目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。
    
     一、基本理論
     (一) 分子篩效益
     一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時(shí)，各分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行著兩種不同的運(yùn)動(dòng)：垂直向下的移動(dòng)和無定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動(dòng)的過程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子小的后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有大限和小限。分子直徑比凝膠大孔隙直徑大的，就會(huì)全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會(huì)有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會(huì)有三種情況，一是分子很小，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙；二是分子很大，*不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對(duì)于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動(dòng)距離較短，分子較小的移動(dòng)距離較長。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時(shí)阻力較大，小分子通過時(shí)阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時(shí)，按照分子量大小“排隊(duì)，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。
    
     二)色譜柱的重要參數(shù)
     ⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt 表示。
     ⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。
     ⑶內(nèi)水體積：因?yàn)槟z為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。 不包括固體支持物的體積(Vg)。
     ⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve 表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時(shí)，(與洗脫體積比較可以忽略不計(jì))，在洗脫圖中，從加樣到峰位置所用洗脫液體積為Ve。 當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從樣品體積的一半到峰位置。當(dāng)樣品很大時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點(diǎn)(或半高處)。
    
     二、凝膠的種類及性質(zhì)
     (一) 交聯(lián)葡聚糖凝膠
     ⑴Sephadex G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex，不同規(guī)格型號(hào)的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。
     ⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。
    
     (二) 瓊脂糖凝膠：
     商品名很多，常見的有，Sepharose(瑞典，pharmacia )，Bio-Gel-A(美國Bio-Rad)等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級(jí)鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用(如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液)。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。
    
     (三)聚丙烯酰胺凝膠：是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位， 由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-P (Bio-Gel P)，由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號(hào)很多，從P-2P-300共10種，P 后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。
    
     (四)聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel ， 具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)， 可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用甲基亞砜。
    
     三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)
     (一)層析柱 層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外， 直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時(shí)用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級(jí)分離時(shí)柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在分離時(shí)，死體積不能超過總床體積的1/1000。
    
     (二)凝膠的選擇 根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量為20，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200號(hào)篩目的的Sephadex G-200效果好， 脫鹽用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。
    
     (三)凝膠的制備 商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時(shí)內(nèi)即可完成。別是在使用軟膠時(shí)， 自然膨脹需24小時(shí)數(shù)天，而用加熱法在幾小時(shí)內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。
    
     (四)樣品溶液的處理 樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過Sephadex G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4%，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4%(一般約0.5-2ml)，進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10%，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30%。 分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。
    
     (五)防止微生物的污染 交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:
     ⑴疊氨鈉(NaN3)在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水，在20℃時(shí)約為40%；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會(huì)改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。
    
     ⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果佳，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時(shí)易引起分解而失效。
    
     ⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉 在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01%。在微酸性溶液中為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。
    
     ⑷苯基汞代鹽 在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01%。在微堿性溶液中抑效果佳，長時(shí)間放置時(shí)可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。

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